ColabFold：低门槛蛋白结构预测工作流

ColabFold（Mirdita 等，Nature Methods 2022）解决了 AlphaFold2 最大的实用障碍：MSA 搜索太慢、数据库太大。它用 MMseqs2 替代 HHblits/Jackhmmer，把搜索时间从数小时压缩到数分钟，且通过远程服务器提供，用户无需下载任何数据库。

核心改进

	官方 AlphaFold2	ColabFold
MSA 搜索工具	Jackhmmer + HHblits	MMseqs2
搜索耗时	数十分钟～数小时	数分钟
数据库	需本地下载 > 2 TB	远程服务器，无需下载
运行环境	需自建 GPU 环境	Google Colab 免费 GPU
易用性	命令行 + 配置	网页点击即用
模型	AF2	AF2、AF2-multimer

「让原本需要专业运维支持的工具变成人人可用」是 ColabFold 最大的贡献——它的实际影响可能超过任何算法改进。

三种使用方式

# 方式一：Google Colab（最简单，适合零星使用）
#   打开 https://github.com/sokrypton/ColabFold
#   点 AlphaFold2.ipynb 的 Colab 徽章
#   粘贴序列 → 运行 → 下载结果
#   免费 GPU 有时长限制，长序列可能超时

# 方式二：本地安装（适合批量与敏感数据）
pip install "colabfold[alphafold]"
# 或使用官方安装脚本 install_colabbatch_linux.sh

colabfold_batch input.fasta output_dir/

# 常用参数：
colabfold_batch input.fasta output_dir/ \
  --num-recycle 6 \
  --num-models 5 \
  --num-seeds 3 \
  --amber \
  --templates \
  --model-type auto

# 方式三：本地 MMseqs2 数据库（完全离线）
#   适合有保密要求的序列
#   需要下载 ColabFoldDB（约 1 TB，仍远小于官方数据库）
colabfold_search input.fasta /path/to/db/ msas/
colabfold_batch msas/ output_dir/

关键参数的作用

# --num-recycle（默认 3）
#   循环回收次数，把预测结果再输入网络精化
#   增加到 6~12 通常能改善难预测的序列
#   代价：时间线性增长
#   → 【对低置信度的预测，先试试加大这个参数】

# --num-models（默认 5）
#   AF2 有 5 个训练好的模型，各自预测
#   → 保留全部可以看预测的一致性
#   → 5 个模型结果差异大 = 该预测不可靠

# --num-seeds（默认 1）
#   每个模型用不同随机种子多次预测
#   → 采样构象多样性
#   → 对可能有多构象的蛋白很有用

# --amber
#   用 Amber 力场做结构弛豫
#   修正键长键角与侧链冲突
#   → 【如果要用于 MD 或对接，建议开启】
#   → 只影响局部几何，不改变整体折叠

# --templates
#   使用 PDB 中的同源结构作为模板
#   → 对有近缘结构的蛋白有帮助
#   → 但也可能把模板的构象偏好带进来
#   → 【想预测非模板构象时应关闭】

# --msa-mode
#   mmseqs2_uniref_env  默认，最全
#   mmseqs2_uniref      只用 UniRef，更快
#   single_sequence     【不用 MSA】—— 用于测试无 MSA 时的表现

# --pair-mode（多链）
#   unpaired_paired  默认
#   paired           只用配对的 MSA（对复合物更好）
#   unpaired         不配对

多链复合物预测

# 输入 FASTA 中用冒号分隔各链
# input.fasta:
#   >complex_AB
#   MKTAYIAKQRQISFVKSHFSRQ:MSKGEELFTGVVPILVELDGDV

colabfold_batch complex.fasta out/ \
  --model-type alphafold2_multimer_v3 \
  --num-recycle 12 \
  --num-models 5

# 同源多聚体：重复同一序列
#   >homodimer
#   MKTAYIAK...:MKTAYIAK...

# 判读多链预测：
#   看 ipTM（界面置信度）而非只看 pLDDT
#     ipTM > 0.8   界面很可能正确
#     ipTM 0.6~0.8 不确定
#     ipTM < 0.6   界面预测不可靠
#
#   看链间 PAE
#     两条链间的 PAE 低 = 相对取向可信
#     PAE 高 = 各链结构可信但相对位置不可信
#
#   看多个模型的一致性
#     5 个模型给出相似的界面 = 更可信
#
# 提醒：
#   AF2-Multimer 对【弱瞬时相互作用】预测不可靠
#   对抗体-抗原界面表现也不佳（见 364）
#   → 复合物预测建议用 Boltz-2 或 Chai-1（见 121、122）

输出文件的解读

文件	内容
*_relaxed_rank_001_*.pdb	最佳模型（Amber 弛豫后）
*_unrelaxed_rank_*.pdb	未弛豫的原始预测
*_scores_rank_*.json	pLDDT、PAE、pTM、ipTM
*_predicted_aligned_error_v1.json	PAE 矩阵
*.a3m	MSA（可复用，省去重新搜索）
*_coverage.png	MSA 覆盖度图
*_PAE.png	PAE 热图
*_plddt.png	逐残基 pLDDT 曲线

先看 *_coverage.png：如果 MSA 很浅（同源序列少），说明预测的先天条件就不好，不必对结果期望太高。

实用技巧

• 保存并复用 MSA：.a3m 文件可以直接作为输入，跳过搜索——调参重跑时能节省大量时间；
• 低置信度时的应对顺序：① 增加 --num-recycle；② 检查 MSA 覆盖度；③ 尝试 --templates；④ 分域分别预测（长的多域蛋白）；
• 探索多构象：增加 --num-seeds，并尝试 --max-msa 32:64 这类降低 MSA 深度的设置——减少 MSA 有时能让模型采样到不同的构象状态，这是研究构象变化的一个技巧；
• 长序列显存不足：分域预测，或用 --use-gpu-relax false；
• 敏感序列：不要用远程 MMseqs2 服务器——序列会发送到外部。用本地数据库方案。

延伸资源

• AlphaFold2：112《AlphaFold2 论文精读》；OpenFold：117《OpenFold》；ESMFold：116《ESMFold 论文精读》；
• AlphaPulldown：119《AlphaPulldown》；Boltz-2：121《Boltz-2 技术报告精读》。