AlphaPulldown：蛋白复合物预测的实用工具

AlphaPulldown（Yu 等，Bioinformatics 2023）把 AlphaFold-Multimer 从「预测一个复合物」变成「批量筛选哪些蛋白对可能相互作用」——相当于用计算做「虚拟的 pull-down 实验」。

解决的问题

# 手工用 AF2-Multimer 预测复合物的麻烦：
#   1) 每对蛋白都要单独准备输入
#   2) MSA 搜索被重复执行（同一蛋白在多个组合中出现）
#   3) 结果分散，难以批量比较
#   4) 没有统一的筛选判据
#
# AlphaPulldown 的做法：
#   1) 【先为每个蛋白单独算一次 MSA 特征并缓存】
#      → 这是最关键的优化
#      → N 个蛋白只需 N 次 MSA 搜索，而非 N² 次
#   2) 组合阶段直接复用缓存的特征
#   3) 批量运行所有组合
#   4) 输出统一的评分表格便于排序
#
# 效率提升：
#   筛选 50 个蛋白的两两组合（1225 对）
#   传统方式：1225 × 2 次 MSA 搜索
#   AlphaPulldown：50 次 MSA 搜索
#   → 【数量级的差异】

三种筛选模式

模式	说明	典型用途
pulldown	一个「诱饵」× 一组「候选」	找某蛋白的相互作用伙伴
all_vs_all	一组蛋白的所有两两组合	构建相互作用网络
homo-oligomer	同一蛋白的多聚体	判断寡聚状态
custom	自定义组合与片段	域级别的相互作用定位

使用流程

pip install alphapulldown

# ---- 第一步：为每个蛋白计算并缓存特征 ----
create_individual_features.py \
  --fasta_paths=all_proteins.fasta \
  --data_dir=/path/to/alphafold_databases \
  --output_dir=features/ \
  --max_template_date=2024-01-01 \
  --skip_existing=True

# 这一步最慢（每个蛋白的 MSA 搜索）
# 但只需做一次，之后所有组合复用

# ---- 第二步：定义要预测的组合 ----
# bait.txt:
#   PROTEIN_A
# candidates.txt:
#   PROTEIN_B
#   PROTEIN_C
#   PROTEIN_D

# custom 模式还可以指定片段：
# custom.txt:
#   PROTEIN_A,1-200;PROTEIN_B      A 的 1-200 区域 与 B
#   PROTEIN_A,201-400;PROTEIN_B    A 的 201-400 区域 与 B
#   → 【这样能定位是哪个域负责相互作用】

# ---- 第三步：批量预测 ----
run_multimer_jobs.py \
  --mode=pulldown \
  --num_cycle=3 \
  --num_predictions_per_model=1 \
  --output_path=predictions/ \
  --data_dir=/path/to/alphafold_databases \
  --protein_lists=bait.txt,candidates.txt \
  --monomer_objects_dir=features/ \
  --job_index=$SLURM_ARRAY_TASK_ID     # 支持集群阵列作业

# ---- 第四步：汇总结果 ----
create_notebook.py --cutoff=5.0 \
  --output_dir=predictions/ \
  --pae_figsize=50

singularity exec --bind $PWD:/mnt \
  alpha-analysis.sif run_get_good_pae.sh \
  --output_dir=/mnt/predictions --cutoff=10

判据：如何判断「可能有相互作用」

# AlphaPulldown 输出的关键指标
#
# 1) ipTM（界面预测的 TM-score）
#    最重要的单一指标
#      > 0.8   高置信度界面
#      0.6~0.8 中等
#      < 0.6   不可靠
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# 2) pDockQ / mpDockQ
#    综合了 pLDDT 与界面接触数的评分
#      pDockQ > 0.5  较可信
#      pDockQ > 0.23 弱信号
#    对多链体系用 mpDockQ
#
# 3) 界面 PAE
#    两条链之间残基对的 PAE
#    低 PAE 区块 = 该界面的相对位置可信
#    → 【比 ipTM 更直观地显示「哪部分界面可信」】
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# 4) 界面接触残基数
#    太少（< 10）可能是偶然接触
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# 5) 多模型/多种子的一致性
#    不同模型是否给出相似的界面
#    → 【这是最实用的判据之一】
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# 综合判断（建议的筛选流程）：
#   ipTM > 0.6 且 pDockQ > 0.23
#   且 界面 PAE 有明显的低值区块
#   且 多个模型的界面一致
#   → 才作为候选进入实验验证

结果解读的重要提醒

• 高分不等于真实相互作用。这是最需要警惕的。AF-Multimer 可能对「结构上兼容但生物学上不会相遇」的蛋白对给出高分——它不知道两个蛋白是否在同一个细胞区室、同一时间表达；
• 低分不等于没有相互作用：弱的、瞬时的相互作用（信号通路中很常见）AF-Multimer 普遍预测不好；翻译后修饰依赖的相互作用也预测不了；
• 必须结合生物学背景：共定位、共表达、已知通路——计算筛选只是产生假设，不是证据；
• 假阳性率的现实：在大规模筛选中，即使用严格阈值，假阳性仍然不少。把它当作「排序工具」而非「判定工具」；
• 需要实验验证：共免疫沉淀、pull-down、SPR、交联质谱等。

在药物发现中的用途

场景	说明
PPI 靶点的界面表征	为 PPI 抑制剂设计提供结构基础（见 382《PPI 抑制剂》）
降解剂的三元复合物	预测 E3 连接酶-降解剂-靶蛋白（见 356《PROTAC 是什么》）
靶点通路研究	找靶蛋白的相互作用伙伴
脱靶预测	某蛋白可能与哪些蛋白结合
域级定位	用 custom 模式找出负责结合的具体区域
抗体-抗原	效果有限（见 364《抗体结构预测》）

计算成本的现实

• MSA 阶段：每个蛋白数分钟到数十分钟（用 MMseqs2 可加速，见 118《ColabFold》）；
• 预测阶段：每对复合物在 GPU 上数分钟到数十分钟，取决于总长度；
• all_vs_all 的组合爆炸：N 个蛋白有 N(N−1)/2 对，50 个蛋白就是 1225 对——需要集群资源；
• 实际建议：先用 pulldown 模式针对具体假设做小规模筛选，而非盲目做 all_vs_all；
• 集群支持：--job_index 参数支持 SLURM 阵列作业，这是大规模运行的必要条件。

延伸资源

• ColabFold：118《ColabFold》；AlphaFold2：112《AlphaFold2 论文精读》；
• PPI 靶点：382《PPI 抑制剂》；降解剂三元复合物：356《PROTAC 是什么》。