ProteinMPNN 论文精读：逆折叠模型为什么改变蛋白设计流程

ProteinMPNN（Dauparas 等，Science 2022）解决逆折叠问题：给定蛋白的三维骨架，设计出能折叠成该结构的氨基酸序列。它把这个任务的实验成功率从个位数百分比提升到了相当高的水平，是蛋白设计流程中影响最大的工具之一。

逆折叠：结构预测的反问题

	结构预测	逆折叠
输入	序列	三维骨架
输出	三维结构	序列
解的数量	通常唯一	多解（很多序列能折叠成同一结构）
代表方法	AlphaFold（见 112《AlphaFold2 论文精读》）	ProteinMPNN

「多解」这个性质很重要：逆折叠不需要找到「唯一正确答案」，只需要找到任何一个能稳定折叠的序列——这让问题比结构预测更宽容，也是它成功率能做高的原因之一。

关键设计

# 1) 【只用主链信息】
#    输入特征：主链原子（N, CA, C, O）之间的距离与角度
#    → 【不使用侧链信息】
#
#    为什么重要：
#      设计时我们只有骨架，没有侧链
#      → 模型必须能只靠主链工作
#      → 这个设定与实际使用场景完全一致
#
# 2) 【自回归解码 + 随机顺序】
#    逐个位置生成氨基酸，
#    但【解码顺序是随机的】而非从 N 端到 C 端
#
#    好处：
#      - 模型学会在任意上下文下预测
#      - 支持【部分固定序列】的设计
#        （固定某些位置，只设计其余）
#      → 这个能力在实际设计中极其有用
#
# 3) 【加噪训练】
#    训练时给主链坐标加高斯噪声
#    → 模型对不完美的骨架更稳健
#    → 【这对下游很关键】：
#      RFdiffusion 生成的骨架不是完美的晶体结构，
#      加噪训练让 ProteinMPNN 能处理它们
#
# 4) 【消息传递网络】
#    在残基图上做消息传递（k 近邻图）
#    → 编码空间邻近关系
#
# 5) 【温度参数】
#    控制生成的多样性
#    低温 → 保守，接近最可能的序列
#    高温 → 多样，探索更多可能

使用

git clone https://github.com/dauparas/ProteinMPNN.git
cd ProteinMPNN

# 基本用法
python protein_mpnn_run.py \
  --pdb_path input_backbone.pdb \
  --pdb_path_chains "A" \
  --out_folder output/ \
  --num_seq_per_target 8 \
  --sampling_temp "0.1" \
  --seed 37 \
  --batch_size 1

# 【固定某些位置】（非常常用）
#   如：保留活性位点残基，只设计其余部分
python protein_mpnn_run.py \
  --pdb_path input.pdb \
  --fixed_positions_jsonl fixed_positions.jsonl \
  --out_folder output/ \
  --num_seq_per_target 32

# fixed_positions.jsonl 格式：
#   {"input": {"A": [10, 25, 33, 78]}}
#   → A 链的这些位置保持原序列不变

# 【偏置特定氨基酸】
#   如：避免半胱氨酸（防止二硫键干扰）
#       或增加带电残基（提高溶解度）
python protein_mpnn_run.py \
  --pdb_path input.pdb \
  --bias_AA_jsonl bias.jsonl \
  --out_folder output/

# bias.jsonl:
#   {"C": -3.0, "M": -1.0, "E": 0.5, "K": 0.5}
#   → 负值抑制，正值鼓励

# 【多链设计】
#   支持指定哪些链设计、哪些链固定
#   → 用于设计结合蛋白（固定靶蛋白，设计结合物）

# 输出：FASTA 文件，每条序列带 score 与 recovery
#   score:    模型的负对数似然（越低越好）
#   recovery: 与原序列的一致率（用于验证时参考）

在蛋白设计流程中的位置

# 现在的标准从头设计流程：
#
# 第 1 步：【生成骨架】
#   RFdiffusion（见 151）
#   → 根据目标（结合某个靶点、形成某种拓扑）
#     生成三维主链
#
# 第 2 步：【设计序列】
#   ProteinMPNN
#   → 为骨架找到能折叠成它的序列
#   → 通常生成 8~64 条候选序列
#
# 第 3 步：【验证折叠】
#   AlphaFold2 / ESMFold（见 112、116）
#   → 预测设计序列的结构
#   → 与目标骨架比较 RMSD
#
#   【筛选判据】：
#     RMSD < 2 Å
#     pLDDT > 80
#     （结合物设计还要看 ipTM）
#   → 通过率通常只有一小部分
#
# 第 4 步：【实验验证】
#   基因合成 → 表达 → 纯化 → 表征
#   → 测稳定性、结合活性、结构
#
# 【关键认识】：
#   计算筛选的通过率与实验成功率是两回事
#   即使 AF2 验证通过，实验成功率仍然有限
#   → 通常需要测试数十到上百个设计
#
# 【ProteinMPNN 的贡献】：
#   它把第 2 步的质量大幅提高，
#   使得第 3 步的通过率、第 4 步的成功率都显著上升
#   → 【这是整个流程能跑通的关键环节】

LigandMPNN：考虑配体环境

• 问题：ProteinMPNN 只看蛋白主链，不知道口袋里有配体——设计出的残基可能与配体冲突；
• LigandMPNN：把小分子、金属离子、核酸也作为输入环境，在设计序列时考虑与它们的相互作用；
• 应用：
  • 设计小分子结合口袋（配合 RFAA/RFdiffusion All-Atom，见 115《RoseTTAFold All-Atom》）；
  • 人工酶设计（活性位点周围的残基）；
  • 金属蛋白设计；
  • 改造现有蛋白的结合特异性。
• 实践建议：只要设计的区域附近有配体或辅因子，就应该用 LigandMPNN 而非 ProteinMPNN。

使用中的要点

• 温度参数的选择：0.1～0.3 较保守（推荐起点），0.5 以上更多样但风险高。建议在多个温度下各生成一批；
• 生成多条序列并筛选：单条序列的成功率有限，标准做法是生成数十条，用 AF2 验证后挑选；
• 序列恢复率不是目标：与天然序列一致率高不代表设计好——我们要的是「能折叠」，不是「像天然的」；
• 注意可表达性：设计的序列可能难以在大肠杆菌中表达。可以用氨基酸偏置调整（如减少稀有密码子对应的残基、控制疏水性）；
• 溶解度：设计时可通过偏置增加表面的带电残基。

延伸资源

• RFdiffusion：151《RFdiffusion 论文精读》；RoseTTAFold All-Atom：115《RoseTTAFold All-Atom》；
• AlphaFold2 验证：112《AlphaFold2 论文精读》；ESMFold：116《ESMFold 论文精读》；ESM-2：143《ESM-2 论文精读》。