微粒体稳定性 Microsomal Stability：肝代谢风险早期判断

肝微粒体稳定性是先导优化中做得最多的 ADME 实验。它成本低、通量高、周期短，但它只反映一部分代谢途径——理解这个边界，才不会被数据误导。

微粒体包含什么

# 肝微粒体 = 内质网碎片的囊泡
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# 富含：
#   - CYP450 酶系（主要）
#   - UGT（葡萄糖醛酸转移酶，需加 UDPGA）
#   - FMO（黄素单加氧酶）
#   - 羧酸酯酶（部分）
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# 不含或很少：
#   - 醛氧化酶（AO）—— 胞质酶
#   - 黄嘌呤氧化酶 —— 胞质酶
#   - 硫酸转移酶（SULT）—— 胞质酶
#   - 谷胱甘肽 S-转移酶（GST）—— 主要在胞质
#   - N-乙酰转移酶（NAT）—— 胞质酶
#   - 转运体（摄取与外排）
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# 后果：
#   如果化合物主要通过这些途径代谢，
#   微粒体实验会显示「很稳定」，但体内清除很快
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# 醛氧化酶尤其值得注意：
#   它代谢含氮杂环（如喹唑啉、酞嗪），
#   在人体中活性高于常用实验动物
#   → 「大鼠 PK 很好但人体清除快」的常见原因之一

实验设计要点

参数	典型值	说明
化合物浓度	0.5～1 μM	必须远低于 Km，避免饱和
微粒体蛋白浓度	0.5 mg/mL	过高会加剧非特异结合
辅因子	NADPH 再生系统	CYP 反应必需
温度	37 °C	—
时间点	0, 5, 15, 30, 45, 60 min	需覆盖足够的消除范围
DMSO 终浓度	≤ 0.5%	过高会抑制 CYP
对照	不加 NADPH 的对照	区分酶促消除与化学不稳定

「不加 NADPH 的对照」经常被省略但很重要：如果化合物在无 NADPH 条件下也消失，说明它是化学不稳定（水解、氧化）或有非特异吸附，而非 CYP 代谢——这两种情况的优化方向完全不同。

数据解读

# 常见的报告方式
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# 1) 半衰期 t½（min）
#    直观但依赖实验条件（蛋白浓度）
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# 2) CLint（μL/min/mg protein）
#    归一化到蛋白量，跨实验可比
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# 3) 「60 分钟剩余百分比」
#    单点，信息量最少，但通量最高
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# 经验分类（人肝微粒体，0.5 mg/mL）：
#   CLint < 10   稳定（低清除）
#   10~30        中等
#   30~100       不稳定
#   > 100        很不稳定（高清除）
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# 注意：
#   这些数字依赖具体实验条件，
#   不同实验室的数据不可直接比较
#   → 必须用内标化合物校准

# 推荐的内标（已知稳定性的参照化合物）：
#   高清除：维拉帕米、丁螺环酮
#   中清除：地西泮
#   低清除：华法林
# 每批实验带上这些，验证微粒体活性正常

物种差异

• 必须同时测人与拟用动物种属：这是最重要的实践建议。物种差异可能很大；
• 常见的物种差异来源：CYP 亚型的表达差异（如人 CYP3A4 vs 大鼠 CYP3A1/2）、醛氧化酶活性（人 > 猴 > 大鼠，犬几乎无活性）、酯酶活性（啮齿类血浆酯酶活性远高于人）；
• 后果：如果人的稳定性远差于大鼠，动物 PK 数据的外推价值就很有限——此时应该更早地做人肝细胞或考虑其它模型；
• 反之亦然：如果人的稳定性好而大鼠差，大鼠 PK 可能低估人体暴露。

从稳定性数据到结构优化

# 光知道「不稳定」不够，必须知道「哪里被代谢」
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# 代谢产物鉴定的流程：
#   1) 延长孵育时间，让代谢产物积累
#   2) LC-MS 全扫描，找出与母体相关的新峰
#   3) 从质量差推断反应类型：
#        +16   羟基化 / N-氧化 / S-氧化
#        +32   双氧化
#        -14   脱甲基（O- 或 N-）
#        +2    还原
#        -2    脱氢
#        +176  葡萄糖醛酸化
#        +80   硫酸化
#   4) MS/MS 碎片分析定位修饰位置
#   5) 必要时合成标准品或用 NMR 确证
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# 拿到代谢位点后的改造策略（见 061）：
#   - 在该位置引入氟或甲基阻断
#   - 用吸电子基团降低该位置的电子密度
#   - 引入位阻
#   - 用等排体替换整个基团
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# 关键提醒：
#   阻断一个位点后，代谢常转移到次优位点
#   → 每次改造后必须重新做代谢产物鉴定

什么时候微粒体数据会误导

• 非 CYP 代谢为主：微粒体显示稳定但体内快（如上述醛氧化酶底物）；
• 需要主动摄取：转运体介导进入肝细胞的化合物，微粒体不反映这一环；
• 高度脂溶性化合物：大量结合到微粒体膜上，自由浓度低，CL_int 被低估。应校正 f_u,inc；
• 肠道代谢显著：口服药物的首过代谢包括肠道 CYP3A4，微粒体只反映肝脏；
• 前药：需要活化的化合物，「消失快」可能正是期望的。

延伸资源

• 肝细胞：085《肝细胞稳定性 Hepatocyte Stability》；体外清除率：083《体外清除率 In Vitro Clearance》；
• 清除率概念：061《清除率 Clearance》；CYP 抑制：058《CYP 抑制》。