CETSA：从细胞热转移看靶点占有

CETSA（Cellular Thermal Shift Assay，细胞热转移分析）把热位移的原理搬到完整细胞、组织甚至体内样本中。它最大的优势是不需要标记或工程化——可以直接测内源蛋白。

原理

# 与 DSF（见 076）同样的物理基础：
#   配体结合稳定蛋白 → 变性温度升高
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# 但在细胞中的操作方式不同：
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# 1) 用化合物处理活细胞（让化合物进入细胞并结合靶点）
# 2) 把细胞分成多份，分别加热到不同温度
# 3) 冷却后裂解细胞
# 4) 离心去除变性沉淀的蛋白
# 5) 检测上清中剩余的可溶靶蛋白
#    （Western blot、AlphaLISA、质谱等）
# 6) 绘制「可溶蛋白量 vs 温度」曲线
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# 有配体结合 → 蛋白在更高温度下仍保持可溶 → 曲线右移
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# 两种实验模式：
#   - 熔解曲线（固定化合物浓度，变温度）→ 得 ΔTagg
#   - 等温剂量响应（固定温度，变浓度）→ 得细胞内 EC50
#     （ITDRF-CETSA，更适合 SAR 比较）

核心优势

优势	说明
内源蛋白	不需要过表达或加标签，避免人为改变
无需标记化合物	不必合成探针
可用原代细胞与组织	甚至可用给药后的动物组织
包含细胞环境	通透性、外排、竞争者、蛋白伙伴
可做蛋白组学版本	一次评估全蛋白组的靶点参与（见下）

「可用给药后的动物组织」是它独有的能力：给动物用药后取组织做 CETSA，可以直接证明药物在体内到达了靶组织并结合了靶点——这是最有说服力的靶点参与证据之一（见 408《药效模型 Efficacy Model》）。

热蛋白组学分析（TPP）

# CETSA + 定量质谱 = 全蛋白组范围的靶点参与分析
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# 做法：
#   1) 化合物处理细胞
#   2) 多个温度点加热
#   3) 每个温度点的可溶部分做 TMT 标记定量蛋白组学
#   4) 对每个蛋白拟合熔解曲线
#   5) 找出 Tm 显著改变的蛋白
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# 产出：
#   - 确认预期靶点被结合 ✓
#   - 发现未预期的脱靶 ✓
#   - 发现下游通路蛋白的稳定性变化
#     （间接效应，如复合物组成改变）
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# 这是无偏的脱靶发现方法之一，
# 与化学蛋白组学（ABPP，见 379）互补：
#   ABPP 需要探针但灵敏度高
#   TPP 不需探针但只能检测热稳定性变化明显的结合

数据解读的注意事项

• 不是所有结合都产生热位移。这是最重要的局限。如果配体结合在柔性区域、或结合不显著改变蛋白的整体稳定性，可能观察不到位移。阴性结果不能排除结合；
• 位移大小与亲和力非线性：与 DSF 一样，ΔTagg 不能直接换算成 K_D；
• 可能出现负位移：结合导致构象变化使蛋白不稳定，或配体优先结合去折叠态；
• 间接效应：某个蛋白的 Tm 改变可能不是因为化合物直接结合，而是因为其结合伙伴的变化。需要用重组蛋白验证直接结合；
• 检测方法的限制：Western blot 半定量、通量低；质谱通量高但对低丰度蛋白灵敏度有限；
• 加热可能改变化合物：热不稳定的化合物需注意。

与 NanoBRET 的选择

	CETSA	NanoBRET（见 077《NanoBRET》）
需要工程化	否	是（融合 NanoLuc）
需要示踪剂	否	是
定量性	半定量	较好
通量	中（质谱版本高）	高
可用原代细胞/组织	可以	困难
全蛋白组分析	可以（TPP）	不可以
适用靶点	需有热稳定性响应	需有合适示踪剂

实际选择：需要 SAR 排序与高通量 → NanoBRET；需要用内源蛋白、原代细胞或体内样本 → CETSA；需要无偏的脱靶发现 → TPP。

在项目中的关键应用

• 证明靶点参与：这是 CETSA 最核心的价值。细胞表型 + CETSA 阳性 = 表型很可能来自该靶点；
• 体内靶点参与：给药后取组织做 CETSA，证明药物到达并结合了靶点。这在药效实验中是关键对照——如果药效实验阴性但 CETSA 显示靶点未被结合，问题是暴露不足而非靶点错误（见 408《药效模型 Efficacy Model》）；
• 脱靶发现：TPP 提供无偏的全蛋白组视角；
• 诊断细胞活性缺失：生化活性好但细胞无效时，CETSA 能区分「没进细胞」与「进了但没效应」。

延伸资源

• NanoBRET：077《NanoBRET》；DSF：076《DSF/TSA》；
• 细胞靶点结合：079《Cellular Target Engagement》；药效模型：408《药效模型 Efficacy Model》。