DSF/TSA：快速评估靶点结合的热稳定性方法

差示扫描荧光法（DSF），也称热位移分析（TSA, Thermal Shift Assay），通过测量配体结合导致的蛋白热稳定性变化来判断结合。它的最大优势是通量高、样品需求少、不需要开发特异性检测方法。

原理

# 基本逻辑：
#   配体结合稳定蛋白结构 → 蛋白变性所需温度升高
#
# 测量方式：
#   加入环境敏感的荧光染料（如 SYPRO Orange）
#   染料在水中荧光弱，结合到疏水表面时荧光强
#
#   蛋白折叠时 → 疏水核心被埋藏 → 荧光弱
#   蛋白变性时 → 疏水核心暴露 → 荧光强
#
#   缓慢升温，记录荧光 vs 温度曲线
#   → S 形曲线，拐点即熔点 Tm
#
# 热位移：
#   ΔTm = Tm(有配体) - Tm(无配体)
#
#   ΔTm > 2°C   通常提示有结合
#   ΔTm > 5°C   较强结合
#
# 设备：普通的实时定量 PCR 仪即可（有温度梯度与荧光检测）
# → 这是它易于普及的关键原因

优势与适用场景

优势	说明
通量高	96/384 孔板，一次数小时
样品少	每孔微克级蛋白
无需特异性检测	不用开发酶活或结合分析方法
设备普及	qPCR 仪即可
可测任何位点	不限于活性位点
额外用途	缓冲液优化、蛋白质量控制

「缓冲液优化」是一个被低估的用途：用 DSF 快速筛选几十种缓冲液条件（pH、盐、添加剂），找出让蛋白最稳定的配方——这对后续的结晶、SPR、长期储存都很有价值。

数据解读的注意事项

• ΔTm 与亲和力不是简单的线性关系。这是最重要的一条。ΔTm 取决于结合亲和力、结合焓、蛋白的变性热力学等多个因素。不能直接把 ΔTm 换算成 K_D，也不能用 ΔTm 排序亲和力——只能作为「有无结合」的定性判断与粗略排序；
• 负位移也可能是真结合：如果配体优先结合去折叠态，或结合导致构象变化使蛋白不稳定，会观察到 Tm 下降。不要因为 ΔTm 为负就排除；
• DMSO 影响 Tm：必须做 DMSO 浓度匹配的对照；
• 化合物自身荧光干扰：某些化合物在 SYPRO Orange 的检测波长有荧光或猝灭作用，产生假信号。需要看原始曲线形状而非只看拟合出的 Tm；
• 聚集造成的假象：化合物导致蛋白聚集时，曲线形状异常；
• 膜蛋白与含大量无序区的蛋白：可能没有清晰的熔解转变，方法不适用。

曲线质量的判断

# 好的 DSF 曲线特征：
#   - 起始基线平稳且低
#   - 单一、清晰的 S 形转变
#   - 高温平台稳定（或缓慢下降，因染料解离）
#   - 重复孔一致
#
# 异常曲线及其含义：
#
# 1) 起始荧光就很高
#    → 蛋白部分变性或已聚集
#    → 或化合物自身荧光
#
# 2) 双转变（两个拐点）
#    → 蛋白有多个结构域，分别熔解
#    → 或样品不均一
#
# 3) 无明显转变
#    → 蛋白高度稳定（Tm 超出温度范围）
#    → 或蛋白已变性
#    → 或缺少可结合染料的疏水核心
#
# 4) 高温端荧光下降剧烈
#    → 蛋白聚集沉淀，染料被包裹
#
# 关键实践：
#   永远检查原始曲线，不要只看软件拟合出的 Tm 数字

在筛选流程中的位置

• 片段筛选的主力方法之一：片段的亲和力很弱（mM 级），常规活性测定难以检出，而 DSF 对弱结合仍有一定灵敏度；
• 初筛后必须正交验证：DSF 的假阳性与假阴性率都不低，命中必须用 SPR、ITC 或活性实验确认；
• 不适合精确的 SAR 排序：ΔTm 与亲和力的非线性关系使它不适合细致比较；
• 适合快速判断「有没有结合」：在没有活性检测方法时（如结构蛋白、支架蛋白），DSF 可能是最快的路径。

相关方法

方法	特点
DSF（染料法）	最常用；需要疏水核心；受化合物荧光干扰
nanoDSF	测色氨酸内源荧光；无需染料，避免干扰；设备较贵
DSC	量热法；无需标记；样品需求大、通量低
CETSA（见 078《CETSA》）	在细胞中做的热位移，反映细胞内结合
SPR / ITC	定量准确但通量低（见 074《SPR 实验》、075《ITC 实验》）

nanoDSF 值得优先考虑：它测蛋白内源的色氨酸/酪氨酸荧光，不需要外加染料，因此避免了化合物-染料相互作用造成的干扰——这是 DSF 最主要的假阳性来源。

延伸资源

• SPR：074《SPR 实验》；ITC：075《ITC 实验》；CETSA：078《CETSA》；
• 命中确认：402《Hit Identification》。