体外清除率 In Vitro Clearance：如何预测体内代谢稳定性

体外内在清除率（CL_int）在肝微粒体或肝细胞中测定，用于预测体内的肝清除率。它是先导优化中最常用的代谢终点，也是 IVIVE（体外到体内外推）的起点。

CL_int 的测定与计算

# 底物消除法（最常用）
#
# 1) 化合物（低浓度，通常 1 μM）与肝微粒体/肝细胞孵育
# 2) 在多个时间点取样（如 0, 5, 15, 30, 45, 60 min）
# 3) LC-MS/MS 定量剩余化合物
# 4) 对 ln(剩余%) vs 时间做线性拟合，得斜率 k
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#   t½ = 0.693 / k
#
#   CLint = (0.693 / t½) × (孵育体积 / 蛋白量)
#         = k × V / (mg protein)
#
#   单位：μL/min/mg protein（微粒体）
#         μL/min/10⁶ cells（肝细胞）

import numpy as np
from scipy import stats

def calculate_clint(times_min, pct_remaining,
                    incubation_volume_ul=200, protein_mg=0.1):
    """从消除曲线计算 CLint"""
    ln_pct = np.log(np.array(pct_remaining))
    slope, intercept, r, p, se = stats.linregress(times_min, ln_pct)
    k = -slope                              # min⁻¹
    t_half = 0.693 / k if k > 0 else np.inf
    clint = k * incubation_volume_ul / protein_mg   # μL/min/mg
    return {
        "k": round(k, 5), "t_half_min": round(t_half, 1),
        "CLint": round(clint, 1), "r_squared": round(r**2, 3),
    }

# 数据质量判断：
#   R² > 0.9 才可靠
#   消除应在 > 20% 到 < 80% 的范围内有足够数据点
#   消除太快（60 min 内 > 90%）→ 需要缩短时间点
#   消除太慢（60 min 内 < 20%）→ 只能给出 CLint 上限

微粒体 vs 肝细胞

	肝微粒体	肝细胞
包含的酶	主要是 CYP、部分 UGT	全部代谢酶 + 转运体
需要辅因子	需外加 NADPH（+UDPGA）	细胞自备
成本	低	高
通量	高	中
适用	早期筛选、CYP 代谢为主的化合物	更接近体内；非 CYP 途径
常见偏差	低估非 CYP 代谢的化合物	相对更准

微粒体的系统性盲区：如果化合物主要通过醛氧化酶（AO）、酯酶、硫酸转移酶、或转运体介导的摄取清除，微粒体会严重低估其清除率。「微粒体很稳定但体内清除很快」的化合物，往往就是这个原因。此时应改用肝细胞或 S9。

IVIVE：外推到体内清除率

# 井搅拌模型（well-stirred model）
#
#   CLh = (Qh × fu_p × CLint,scaled) / (Qh + fu_p × CLint,scaled / fu_inc)
#
# 简化形式（忽略孵育中的非特异结合）：
#   CLh = (Qh × fu × CLint) / (Qh + fu × CLint)

def scale_clint_to_liver(clint_ul_min_mg, species="human"):
    """把体外 CLint 放大到全肝"""
    # 生理换算因子（示例值，实际应查最新文献）
    PARAMS = {
        "human": {"mg_protein_per_g_liver": 45, "g_liver_per_kg": 25.7,
                  "Qh_ml_min_kg": 20.7},
        "rat":   {"mg_protein_per_g_liver": 45, "g_liver_per_kg": 40,
                  "Qh_ml_min_kg": 55},
        "mouse": {"mg_protein_per_g_liver": 45, "g_liver_per_kg": 55,
                  "Qh_ml_min_kg": 90},
    }
    p = PARAMS[species]
    # μL/min/mg → mL/min/kg
    return (clint_ul_min_mg / 1000
            * p["mg_protein_per_g_liver"] * p["g_liver_per_kg"])

def predict_hepatic_clearance(clint_ul_min_mg, fu_plasma, species="human"):
    QH = {"human": 20.7, "rat": 55, "mouse": 90}[species]
    clint_scaled = scale_clint_to_liver(clint_ul_min_mg, species)
    clh = (QH * fu_plasma * clint_scaled) / (QH + fu_plasma * clint_scaled)
    return {
        "CLint_scaled_ml_min_kg": round(clint_scaled, 1),
        "CLh_predicted_ml_min_kg": round(clh, 2),
        "extraction_ratio": round(clh / QH, 3),
        "classification": ("低提取" if clh / QH < 0.3 else
                           "中提取" if clh / QH < 0.7 else "高提取"),
    }

常见的预测偏差

系统性低估体内清除率：这是 IVIVE 最普遍的问题。可能的原因包括：体外体系缺少某些酶或转运体、孵育中的非特异结合未校正、肝外代谢未计入、以及主动摄取被忽略；
孵育中的非特异结合：脂溶性化合物会结合微粒体膜，实际自由浓度低于名义浓度 → CL_int 被低估。应测定或预测 f_u,inc 并校正；
转运体介导的摄取：某些化合物需要 OATP 主动摄取进入肝细胞，微粒体完全不反映这一点；
肝外代谢：肠道、血浆、肾等部位的代谢；
饱和：如果孵育浓度接近或超过 K_m，测到的不是真正的内在清除率。应使用低浓度（≤ 1 μM）。

提高预测准确性的做法

# 1) 校正孵育中的非特异结合
#    CLint_corrected = CLint_observed / fu_inc
#    fu_inc 可实测或用 logP 的经验公式估算

# 2) 用同种属的体内数据校准
#    先在大鼠上比较预测值与实测值，得到校正因子
#    再把这个因子用于人体预测
#    → 这是最实用的经验做法

# 3) 用肝细胞而非微粒体（如果怀疑非 CYP 途径）

# 4) 做代谢产物鉴定
#    如果微粒体中回收率高但化合物消失慢，
#    而体内清除快 → 提示非 CYP 途径

# 5) 用 PBPK 建模而非简单的井搅拌模型
#    可以纳入转运体、肠道代谢等因素（见 410）

# 6) 关注预测的方向性而非绝对值
#    IVIVE 用于「排序化合物」比「预测绝对清除率」可靠得多
#    → 这也是它在先导优化中的主要用途

在优化中的使用

主要用于排序而非定量预测：同一系列内比较不同分子的代谢稳定性，这个用途相对可靠；
设定目标值：从 TPP 反推。若要每日一次口服，通常需要人 CL_int < 20 μL/min/mg（对应低到中等提取率）；
结合代谢软点识别：光知道「不稳定」不够，要知道「哪里被代谢」才能改（见 061《清除率 Clearance》）；
注意物种差异：大鼠 CL_int 好不代表人也好。应同时测人与拟用动物种属，物种差异大时动物 PK 数据的外推价值有限。

关键要点

微粒体主要反映 CYP 代谢，非 CYP 途径（AO、酯酶、转运体）会被系统性低估；
IVIVE 普遍存在低估倾向，孵育中的非特异结合是重要的可校正因素；
用同种属的体内数据校准，比直接用理论公式更实用；
CL_int 用于排序化合物比预测绝对清除率可靠得多。

延伸资源

微粒体：084《微粒体稳定性 Microsomal Stability》；肝细胞：085《肝细胞稳定性 Hepatocyte Stability》；清除率概念：061《清除率 Clearance》；
PK 参数：406《PK 参数入门》；PBPK：410《IND-Enabling Study》。

CLint 的测定与计算