Caco-2 通透性：肠道吸收体外模型怎么解读

Caco-2 是人结肠腺癌细胞系，在培养中能分化形成类似小肠上皮的极性单层——有紧密连接、微绒毛、以及多种转运体。它是评估口服吸收最广泛使用的体外模型。

实验设计

# 基本设置
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#   Transwell 插入板：上室（apical, A，模拟肠腔）
#                     下室（basolateral, B，模拟血液侧）
#   Caco-2 细胞在膜上培养 21 天分化
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# 双向测定：
#   A→B 方向：模拟吸收
#   B→A 方向：模拟外排
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# 计算表观通透系数：
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#   Papp = (dQ/dt) / (A × C0)
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#   dQ/dt = 接收室中化合物的累积速率（mol/s）
#   A     = 膜面积（cm²）
#   C0    = 供给室初始浓度（mol/cm³）
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#   单位：cm/s，通常报告为 ×10⁻⁶ cm/s

def calculate_papp(amount_receiver_mol, time_s, area_cm2,
                   c0_mol_per_cm3):
    return (amount_receiver_mol / time_s) / (area_cm2 * c0_mol_per_cm3)

# 经验分类：
#   Papp < 1e-6   低通透（预期吸收 < 20%）
#   1~10e-6       中等
#   > 10e-6       高通透（预期吸收 > 70%）

外排比的解读

# 外排比 ER = Papp(B→A) / Papp(A→B)
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#   ER < 2      基本无外排
#   ER 2~3      轻度外排
#   ER > 3      显著外排
#   ER > 10     强外排，可能严重限制吸收
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# 验证是哪个转运体：
#   加特异性抑制剂后重测
#     P-gp:  维拉帕米、环孢素 A、酮康唑
#     BCRP:  Ko143
#     MRP2:  MK-571
#   → 外排比下降说明该转运体参与
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# 重要提醒：
#   外排比高不一定意味着体内吸收差
#   如果被动通透性本身很高，外排泵可能被饱和
#   → 需要结合 Papp(A→B) 的绝对值一起判断
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#   ER 高 + Papp(A→B) 低  → 吸收可能受限 ✗
#   ER 高 + Papp(A→B) 高  → 可能仍能充分吸收 ~

质量控制

检查项	标准	目的
TEER（跨膜电阻）	> 300 Ω·cm²	确认单层完整、紧密连接形成
荧光黄透过率	Papp < 0.5×10⁻⁶ cm/s	确认无旁细胞泄漏
质量平衡	回收率 70%～130%	回收率低提示吸附或代谢
阳性对照	普萘洛尔（高通透）、阿替洛尔（低通透）	验证体系正常
P-gp 底物对照	地高辛（应有高外排比）	验证转运体功能

质量平衡（回收率）是最容易被忽略但最关键的质控：如果回收率只有 30%，说明化合物大量吸附在塑料板上或被细胞代谢/蓄积——此时计算出的 P_app 完全不可信。高脂溶性化合物尤其容易出这个问题。

Caco-2 的局限

• 紧密连接比真实小肠更紧：Caco-2 的 TEER 远高于人小肠，因此会低估旁细胞途径吸收的化合物（小分子亲水化合物）；
• 转运体表达谱与小肠不完全一致：P-gp 表达通常高于生理水平，某些摄取转运体（如 PepT1）表达不足；
• 代谢酶表达低：CYP3A4 表达远低于真实小肠，因此会低估肠道首过代谢；
• 无黏液层：真实肠道有黏液屏障；
• 无肠道菌群与胆汁；
• 批次与实验室间差异大：不同来源、不同传代数的 Caco-2 结果可能差异显著，跨实验室比较绝对值不可靠。

提高数据可用性的做法

# 1) 必须用内标校准
#    每批实验带上已知 Papp 的参照化合物，
#    用它们建立本实验室的分级标准
#    → 只比较相对值，不迷信绝对值

# 2) 对脂溶性化合物加 BSA
#    在接收室加 1~4% BSA，减少非特异吸附，
#    提高回收率与 pH 梯度条件下的数据质量

# 3) 用 pH 梯度
#    上室 pH 6.5（模拟小肠上段），下室 pH 7.4
#    → 更接近生理，对可电离化合物尤其重要

# 4) 与 PAMPA 对照
#    PAMPA 只测被动扩散（见 060）
#    PAMPA 高 + Caco-2 低 → 外排在起作用
#    两者都低 → 被动通透性本身不足
#    → 这个对照能快速定位问题

# 5) 检查是否有代谢
#    同时测供给室与接收室的化合物总量与代谢产物
#    → 回收率低可能是被代谢了

与体内吸收的相关性

• Caco-2 P_app 与人体吸收分数（F_a）有较好的相关性，但关系是S 形而非线性：低通透区分辨率好，高通透区达到平台（都能充分吸收）；
• 主要用于「排除低通透化合物」：判别力在低端最强；
• 不能预测生物利用度 F：F 还包括溶解度、肠道与肝首过代谢（见 063《口服生物利用度 F》）；
• 对主动转运的底物预测不准：Caco-2 的转运体表达与小肠不同。

替代与补充模型

模型	特点
Caco-2	标准模型；需 21 天分化
MDCK-MDR1（见 087《MDCK 通透性》）	3～5 天成膜；转染人 P-gp；通量更高
PAMPA	无细胞；只测被动扩散；最快最便宜
肠类器官	更接近生理；成本高
Ussing chamber	用真实肠组织；通量低

MDCK-MDR1 在筛选阶段常替代 Caco-2：培养周期短得多（3～5 天 vs 21 天），且 P-gp 由转染控制，批次一致性更好。

延伸资源

• MDCK：087《MDCK 通透性》；通透性概念：060《膜通透性 Permeability》；
• 生物利用度：063《口服生物利用度 F》；溶解度：059《水溶性 Solubility》。