肝细胞稳定性 Hepatocyte Stability：比微粒体更接近体内的模型

肝细胞是完整的细胞，包含全部代谢酶（I 相与 II 相）、转运体、以及生理浓度的辅因子。它比微粒体更接近体内实际，代价是成本更高、通量更低。

肝细胞相对微粒体的优势

方面	微粒体	肝细胞
CYP	有	有
胞质酶（AO、SULT、NAT、GST）	缺失	有
II 相结合反应	需外加辅因子，不完整	完整
摄取转运体	无	有（OATP 等）
外排转运体	无	有
细胞膜屏障	无	有（化合物需进入细胞）
辅因子	需外加	细胞自备，生理浓度
成本与通量	低成本、高通量	高成本、中通量

「细胞膜屏障」是一个容易被忽略但重要的差异：在肝细胞实验中，化合物必须先进入细胞才能被代谢。通透性差的化合物在肝细胞中可能显示「稳定」，但这是因为它进不去，而非真的代谢慢——这个信息本身也有价值（提示体内肝清除可能确实较低）。

什么时候必须用肝细胞

• 怀疑非 CYP 代谢：含氮杂环（醛氧化酶底物）、含酚羟基或羧酸（易葡萄糖醛酸化/硫酸化）、含胺（N-乙酰化）；
• 微粒体与体内数据矛盾：微粒体稳定但动物 PK 显示高清除；
• 需要更准确的 IVIVE：候选提名前的人体清除率预测；
• 需要评估转运体介导的摄取：某些化合物的肝清除受 OATP 摄取限速；
• 代谢产物谱的完整表征：II 相代谢产物只有肝细胞才能完整反映。

实验注意事项

# 1) 细胞来源与质量
#    - 新鲜分离 vs 冷冻保存（冷冻更常用，活性略低但方便）
#    - 多供体混合（pooled）vs 单供体
#      → 混合池平均了个体差异，适合常规筛选
#      → 单供体用于研究个体差异（如 CYP2D6 多态）
#    - 活率应 > 80%（台盼蓝染色）
#
# 2) 细胞密度
#    典型 0.5~1 × 10⁶ cells/mL
#    过高会耗尽培养基中的氧与营养
#
# 3) 孵育方式
#    - 悬浮孵育：短时（≤ 4 h），最常用
#    - 贴壁培养：可长时间（数天），但酶活性会下降
#    - 三明治培养：保留极性与胆汁排泄功能
#
# 4) 时长限制
#    悬浮肝细胞在 4 小时后活性显著下降
#    → 对极稳定的化合物，可能无法测出可靠的 CLint
#    → 此时可用「相对活性法」或延长培养体系
#
# 5) 必备对照
#    - 已知高、中、低清除的参照化合物
#    - 活率检查（实验前后）
#    - 阳性对照代谢产物的检出

数据的换算

def hepatocyte_ivive(clint_ul_min_million_cells, fu_plasma,
                     species="human"):
    """肝细胞 CLint 外推到肝清除率"""
    # 生理换算因子（示例）
    PARAMS = {
        "human": {"million_cells_per_g_liver": 99,
                  "g_liver_per_kg": 25.7, "Qh": 20.7},
        "rat":   {"million_cells_per_g_liver": 117,
                  "g_liver_per_kg": 40, "Qh": 55},
    }
    p = PARAMS[species]
    # μL/min/10⁶ cells → mL/min/kg
    clint_scaled = (clint_ul_min_million_cells / 1000
                    * p["million_cells_per_g_liver"] * p["g_liver_per_kg"])
    qh = p["Qh"]
    clh = (qh * fu_plasma * clint_scaled) / (qh + fu_plasma * clint_scaled)
    return {
        "CLint_scaled": round(clint_scaled, 1),
        "CLh_predicted": round(clh, 2),
        "E": round(clh / qh, 3),
    }

# 注意：
#   肝细胞的 IVIVE 通常比微粒体更准，
#   但仍普遍存在低估倾向
#   → 用同种属体内数据校准是必要的

肝细胞的其它用途

• CYP 诱导研究：只有肝细胞能做（需要完整的转录与翻译机制）。测化合物处理后 CYP mRNA 与酶活性的变化（见 058《CYP 抑制》）；
• 代谢产物谱鉴定：包括 II 相结合产物，更接近体内实际；
• 肝毒性评估：细胞活力、线粒体功能、ATP 水平；
• 胆汁排泄：三明治培养的肝细胞可测胆汁排泄指数；
• 转运体研究：摄取转运体的底物/抑制剂鉴定。

更接近体内的模型

模型	特点
悬浮肝细胞	标准方法，4 小时限制
三明治培养肝细胞	保留极性与胆管结构；可测胆汁排泄
肝细胞共培养	与基质细胞共培养，可维持数周活性
3D 肝球体	更接近体内结构；适合长期毒性研究
肝芯片（liver-on-chip）	有流动灌注；仍在发展
人源化肝小鼠	体内模型，含人肝细胞

对极稳定的化合物，长期培养模型（共培养、3D 球体）很有价值：悬浮肝细胞 4 小时内可能测不出可检测的消除，而长期模型能测出低清除化合物的稳定性差异。

延伸资源

• 微粒体：084《微粒体稳定性 Microsomal Stability》；体外清除率：083《体外清除率 In Vitro Clearance》；
• CYP 抑制与诱导：058《CYP 抑制》；清除率：061《清除率 Clearance》。