Hit Identification：如何从筛选命中物开始一个项目

苗头化合物（hit）是项目的第一个可优化起点。这一步的质量直接决定后续几年的工作能否成功——一个假阳性苗头可能浪费整个团队半年时间。

主要的苗头发现策略

策略	规模	适用	典型命中率
高通量筛选（HTS）	10⁵～10⁶	有稳健的检测体系	0.1%～1%（含大量假阳性）
虚拟筛选	10⁶～10¹⁰	有靶点结构	视方法而定，需实验确认
片段筛选（FBDD）	10³～10⁴	难成药靶点	1%～10%（弱结合）
DNA 编码库（DEL）	10⁹～10¹²	可纯化的靶点蛋白	需严格验证
已知配体改造	—	有文献先例	高，但新颖性受限
表型筛选	10⁴～10⁶	靶点未知或多靶点	需机制去卷积
天然产物	—	特殊化学空间	分离鉴定成本高

选择策略的决策依据

• 有高质量结构 + 明确口袋 → 虚拟筛选性价比最高（见 336《用 AutoDock Vina 跑 Docking》）；
• 难成药靶点、浅口袋 → 片段筛选（小分子更容易在浅口袋找到结合点）；
• 有稳健的生化/细胞检测 → HTS；
• 靶点生物学不确定 → 表型筛选（绕开靶点假设风险）；
• 蛋白可纯化且量足 → DEL 提供最大的化学空间覆盖；
• 实践中常常组合使用：虚拟筛选 + 小规模实验验证，成本远低于全库 HTS。

命中确认：最容易被省略也最关键

初筛的「命中」中，相当比例是假阳性。确认流程必须做完整：

# 命中确认的标准流程
#
# 1) 重复验证
#    用新配制的化合物重测，排除孔位效应与操作误差
#
# 2) 剂量-响应曲线
#    单点活性不可信，必须做完整的 8~10 点曲线
#    检查：Hill 系数是否正常（异常陡峭提示聚集或非特异）
#         曲线是否达到平台
#
# 3) 化合物纯度与结构确认
#    LC-MS / NMR 重新确认
#    ← 商业化合物的结构错误或降解是真实存在的问题
#
# 4) 排除干扰机制 —— 最重要的一步
#    a) 聚集体：加去污剂（如 0.01% Triton X-100）重测
#       活性消失 → 是聚集体假阳性
#    b) 光学干扰：检查化合物是否荧光/吸光
#    c) 化学反应性：检查是否含反应性基团
#    d) 氧化还原循环：某些化合物产生 H2O2
#
# 5) 正交检测
#    用原理完全不同的第二种方法验证
#    （如生化活性 + SPR 结合 + 细胞热位移）
#
# 6) 直接结合验证
#    SPR、ITC、NMR、MST 等确认真的结合靶点
#
# 7) 结构确证（最强证据）
#    共晶结构直接看到结合模式
#
# 8) 靶点参与验证
#    突变体实验：关键残基突变后活性应丧失
#    细胞水平：CETSA、靶点占有率

PAINS 与频繁命中者

from rdkit import Chem
from rdkit.Chem import FilterCatalog

params = FilterCatalog.FilterCatalogParams()
for cat in [FilterCatalog.FilterCatalogParams.FilterCatalogs.PAINS_A,
            FilterCatalog.FilterCatalogParams.FilterCatalogs.PAINS_B,
            FilterCatalog.FilterCatalogParams.FilterCatalogs.PAINS_C]:
    params.AddCatalog(cat)
catalog = FilterCatalog.FilterCatalog(params)

def check_pains(smiles):
    mol = Chem.MolFromSmiles(smiles)
    if mol is None:
        return None
    entry = catalog.GetFirstMatch(mol)
    return entry.GetDescription() if entry else None

# 但要理解 PAINS 的正确用法：
#   PAINS 命中 ≠ 一定是假阳性
#   它只是「需要额外验证」的提示
#   某些 PAINS 结构确实有真实活性
#
# 更可靠的判断：
#   1) 查该化合物在多少个不相关 assay 中显示活性
#      （频繁命中者 = 高度可疑）
#   2) 看剂量-响应曲线形状
#   3) 做去污剂对照
#   4) 用正交方法验证

评估苗头质量

指标	关注点
配体高效性（LE）	LE = −ΔG/重原子数；比绝对活性更能预示优化潜力
亲脂高效性（LLE）	LLE = pIC50 − logP；反映活性是否靠疏水性堆出来的
结构新颖性	与已知配体的差异、专利空间
可优化性	有可修饰的位点吗？合成是否可及？
初步选择性	对近缘靶点的选择性
理化性质	MW、logP 是否还有优化空间
SAR 迹象	类似物是否显示合理的构效关系

配体高效性比绝对活性更重要：一个 MW 250、IC50 = 10 μM 的苗头（LE 约 0.4），优化潜力远大于一个 MW 550、IC50 = 1 μM 的苗头（LE 约 0.2）——后者已经用掉了大部分「分子量预算」。

常见陷阱

• 只看活性不看效率：选了一个又大又油的分子作起点，后续优化空间已被耗尽；
• 跳过命中确认直接优化：在假阳性上做几个月 SAR 是最惨的浪费；
• 忽略 SAR 迹象：如果一个化学系列中的类似物活性毫无规律，很可能是非特异性效应；
• 单一苗头系列：应该推进 2～3 个化学系列并行，降低单点失败风险；
• 忽略可合成性：苗头结构如果极难衍生化，SAR 探索会寸步难行。

延伸资源

• 虚拟筛选：336《用 AutoDock Vina 跑 Docking》、337《用 GNINA 做 Rescoring》；筛选数据：245《TDC HTS Group》、242《LIT-PCBA》；
• 下一步：403《Hit Expansion》、404《Hit-to-Lead》。