de novo 蛋白结合物设计：RFdiffusion 走进生物药

从头设计一个能结合指定靶标的蛋白（de novo binder），几年前还是研究课题，现在已有可操作的开源管线。但要清楚它的实际成功率和适用边界，才能合理规划实验投入。

标准三段式管线

阶段	工具	产出
1. 骨架生成	RFdiffusion（见 197《RFdiffusion》）	三维骨架（无序列）
2. 序列设计	ProteinMPNN（见 196《ProteinMPNN》）	能折成该骨架的氨基酸序列
3. 计算验证	AlphaFold2 / ESMFold	自洽性检验，过滤候选
4. 实验验证	高通量表达 + 结合测试	真实命中

第一步：生成骨架

# 结合物设计模式
./scripts/run_inference.py \
  inference.input_pdb=target.pdb \
  'contigmap.contigs=[A17-145/0 70-100]' \
  'ppi.hotspot_res=[A59,A83,A91]' \
  inference.num_designs=1000 \
  inference.output_prefix=out/binder \
  denoiser.noise_scale_ca=0.5 \
  denoiser.noise_scale_frame=0.5

两个参数决定成败：

• contigs：A17-145 表示保留靶标 A 链 17–145 号残基，/0 表示链断开，70-100 表示生成一段 70～100 残基的新链。
• hotspot_res：指定靶标表面你希望结合物接触的关键残基。选择原则：
  • 位于目标功能位点（如要阻断的相互作用界面）；
  • 表面暴露且有一定凹陷；
  • 疏水残基通常是好的锚点；
  • 选 3～5 个，过多会过度约束，过少则设计发散。

noise_scale 降低（如 0.5）通常提高设计质量但降低多样性，是结合物设计的常用设置。

第二步：设计序列

python protein_mpnn_run.py \
  --pdb_path backbone.pdb \
  --pdb_path_chains "B" \
  --out_folder designs/ \
  --num_seq_per_target 48 \
  --sampling_temp "0.1" \
  --omit_AAs "C" \
  --use_soluble_model \
  --seed 37

• --sampling_temp 0.1：低温度更保守、折叠成功率高；
• --omit_AAs "C"：排除半胱氨酸，避免非预期二硫键；
• --use_soluble_model：用可溶性优化的权重；
• 只设计结合物链（--pdb_path_chains "B"），靶标链保持不变。

第三步：计算过滤（决定实验成功率的关键）

# 对每个设计序列，用 AF2 预测复合物结构，检查自洽性

import json
import numpy as np
from Bio.PDB import PDBParser, Superimposer

def filter_designs(design_pdb, af2_pdb, af2_metrics):
    """三个核心判据"""
    checks = {}

    # 1) 自洽性：AF2 预测的结构是否回到设计骨架
    #    判据：Cα RMSD < 2.0 Å
    rmsd = compute_backbone_rmsd(design_pdb, af2_pdb)
    checks["rmsd"] = rmsd
    checks["rmsd_pass"] = rmsd < 2.0

    # 2) 折叠置信度
    #    判据：结合物链的 pLDDT > 80
    checks["binder_plddt"] = af2_metrics["binder_plddt"]
    checks["plddt_pass"] = af2_metrics["binder_plddt"] > 80

    # 3) 界面质量 —— 最关键的判据
    #    判据：pAE_interaction < 10
    checks["pae_interaction"] = af2_metrics["pae_interaction"]
    checks["pae_pass"] = af2_metrics["pae_interaction"] < 10

    checks["all_pass"] = all([checks["rmsd_pass"], checks["plddt_pass"],
                              checks["pae_pass"]])
    return checks

# 可选的额外过滤：
#   - Rosetta 界面能量（ddG）
#   - 埋藏溶剂可及表面积（BSA > 800 Ų 较好）
#   - 形状互补性（shape complementarity）
#   - 无暴露的疏水补丁（可开发性）

pAE_interaction 是最有预测力的单一指标：它衡量 AF2 对「结合物与靶标的相对位置」有多确信。多项工作发现它与实验成功率的相关性最好。

现实的成功率

阶段	典型数量
生成骨架	1,000～10,000
× 每骨架序列数	× 8～48
AF2 回测	数万次预测（算力主要在此）
通过计算过滤	数十到数百
送实验	96 孔板量级
实验命中	个位数到十几个百分点

这个成功率已经远优于以往方法，但意味着一次实验轮次仍需测试几十到上百个设计。把它想象成「一发命中」是不现实的——实验体系必须能支撑这个通量。

难度分级

靶标特征	难度
结构清晰、有明显凹陷、刚性	可行
疏水表面可用作锚点	可行
平坦的 PPI 界面	困难
高度带电或高度亲水表面	困难
柔性区域 / 无序区	很困难
需要构象特异性（只结合某个状态）	很困难
需要极高亲和力（pM 级）	通常需后续优化

从设计到药物还有多远

拿到一个高亲和力的设计蛋白，距离成为药物还有很长的路：

• 可开发性：表达量、可溶性、聚集倾向、热稳定性（见 367《抗体可开发性 Developability》）；
• 免疫原性：人工设计的序列在人体中是完全外源的，免疫原性风险需要认真评估（见 368《免疫原性预测》）；
• 药代：小蛋白清除快，通常需要半衰期延长策略；
• 生产：细胞株开发、纯化工艺；
• 体内功效：体外结合不等于体内有效。

目前 de novo 设计蛋白在诊断、研究工具、以及作为其它模态的组件（如 CAR 的识别域）上的应用，比作为独立治疗药物更成熟。

延伸资源

• 工具：197《RFdiffusion》、196《ProteinMPNN》、195《ESMFold》；公司案例：317《Generate:Biomedicines》；
• 可开发性：367《抗体可开发性 Developability》；免疫原性：368《免疫原性预测》。